康恩泉

2.材料和方法

2.1植物材料和处理

草莓在中国上海青浦的一个商业草莓种植园的十个独立温室中种植（121.10◦ 东部和31.26◦ 北）。

氢纳米气泡水（HNW）由氢纳米气泡水中制造商（液化空气（中国）研发有限公司，有限公司，中国）制造，在溶液中溶解一半的H2约12小时，并通过管道输送至温室。田间种植后，在头两个月对草莓植株施用HNW。以地表水灌溉（SW）为对照，每次处理采用5个独立的温室，均拍摄于2023年3月（图S1）。肥料和杀虫剂是按常规施用的。

2.2.衰变发生率和重量损失的测定

基于草莓表面退化的百分比，建立了六个等级来评估腐烂程度：分别为0%（0）、1-20%（1）、21-40%（2）、41-60%（3）、61-80%（4）和≥81%的果实表面感染（5）。在贮藏期间，每三天测量一次每种水果的重量。重量损失（%）表示为初始重量（0d）的减少百分比。每个处理包含3个重复，每个重复15个果实。

2.3.颜色测量

使用Minolta色度计在水果中心的三个不同位置测量颜色。L*表示从黑色（0）到白色（100）的亮度等级，a*表示从绿色（−120）到红色（+120）的过渡。草莓的颜色变化由L*和a*的值表示。

2.4.总可溶性糖（TSS）、可滴定酸（TA）和维生素C（Vc）含量的测定

TSS的含量根据蒽酮比色法测定。在620nm处检测吸光度。TSS含量通过葡萄糖的标准曲线计算。TA含量（%）是通过使用1%酚酞指示剂测定调节至pH 8.1所需的0.1M NaOH的量来测量的。根据Berk等人描述的方法，使用高效液相色谱法测定Vc含量。流动相为0.1%草酸溶液，流速为1.0 ml min−1，测量波长为254 nm。

2.5.硬度测量

根据Ikegaya等人描述的方法测量水果的硬度。将草莓果实从4℃冰箱中取出，并在室温（20℃）下保存2小时。通过质地分析仪和探针（直径8mm）测量草莓果实的硬度。探针以1毫米s−1的速度穿过水果中心，向下延伸至15毫米深。硬度由最大力值（N）表示。

2.6.细胞壁成分含量的测定

木质素含量通过使用木质素测定试剂盒。根据制造商的指导方针，草莓在实验前在80℃下完全干燥。将约5 mg恒定样品称重至10 ml玻璃管中，并加入1 ml硫酸和20μl高氯酸。木质素的酚羟基经酸化乙酰化后，混合物在280nm处具有特征吸收峰。吸光度与木质素含量呈正相关。最后，通过木质素的标准曲线计算结果，并表示为g kg−1干重。

按照制造商的说明，使用纤维素测定试剂盒测量纤维素含量。简单地说，用0.3g新鲜水果提取纤维素，并将该多糖在强酸中热分解为5-羟甲基糠醛。纤维素裂解物与蒽酮试剂进行显色反应后，在620nm处测定吸光度。将重量相似的样品在80℃下完全干燥，以测定干重。纤维素含量基于葡萄糖的标准曲线计算，并表示为g kg−1干重。

使用半纤维素含量测定试剂盒分光光度法。将样品在80℃下干燥至恒重以提取细胞壁。经过酸处理后，细胞壁中的半纤维素转化为还原糖。半纤维素含量的测定基于还原糖与3，5-二硝基水杨酸（DNS）在540nm下的显色反应。半纤维素含量的结果表示为g kg−1干重。

使用果胶测定试剂盒。称取样品（0.2g），用4ml提取液1在90℃水浴下提取30min。过滤提取物，并将材料重新提取两次。之后，将混合物在25℃下以8000g离心10分钟◦C.将上清液与600μl硫酸混合进行测试。在稀酸中，果胶水解为可溶性果胶，并进一步转化为D-半乳糖醛酸。在强酸中，该衍生物与咔唑缩合为红葡萄酒化合物。在530nm处测量吸光度。果胶含量通过果胶的标准曲线计算，并表示为g kg−1干重。

2.7.感官分析

感官评估小组由南京农业大学的9名学生和1名教职员工组成（5名男性和5名女性，年龄23-55岁）。为了避免偏差，所有样本都使用随机三位数进行编号。在对评估标准进行培训后（根据可接受的水平，为每个独立指标建立5个量表：0-5糟糕、6-10差、11-15中等、16-20好和21-25优秀），小组成员被要求根据香气、光泽、颜色和形状四个特征来评估草莓的质量。总分为100分，每个属性占四分之一。总体评价由上述四个属性的总和表示。

2.8.木质素、纤维素和半纤维素生物合成相关基因的转录分析

使用RNAprep纯植物试剂盒分离总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计测试RNA的浓度和纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性。使用PrimeScript合成cDNA™ 带有gDNA橡皮擦的RT试剂盒。之后，在Mastercycler ep®realplex实时PCR系统上使用SYBR qPCR Master Mix进行qPCR。在用甘油醛3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）和保守假设蛋白1基因（CHP1）的表达水平标准化后，使用2-TΔΔC方法，将基因的相对表达水平表示为相对于相应对照（SW；G期）的值。用于RT-qPCR的所有引物列于表S1中。

2.9.统计分析

本研究中的所有数据均表示为三个独立实验的平均值±标准误差（SE）（感官分析除外）。结果用SPSS 22.0软件进行统计分析。在*P<0.05、**P<0.01或***P<0.001时，使用t检验比较治疗之间差异的统计学显著性。

使用MetaboAnalyst 5.0分析了草莓收获时（0d）细胞壁成分含量、生物合成相关基因变化和硬度之间的相关性。

3.结果

3.1 HNW灌溉能显著改善草莓贮藏期间的表型特征

通常情况下，草莓的颜色会随着储存时间的延长而逐渐变化。与对照组（用地表水灌溉，SW）相比，我们发现HNW灌溉的草莓果实在4℃储存15d期间表现出更好的外观（图第1A段）。在贮藏期的第9天，用SW灌溉的草莓表现出严重的腐烂，而在HNW组中没有观察到腐烂（图1B）。之后，可以清楚地观察到，在储存后期（9-15天），HNW减轻了腐烂的严重程度（图1B）。

对于对照组（SW），L*和a*值在储存过程中逐渐降低（图1C和D）。同时，HNW分别削弱了L*和a*值的降低，尤其是在贮藏后期（12-15天）和中期（6-15天）。HNW灌溉也显著改善了相同储存期内的严重重量损失（图1E）。

3.2.HNW灌溉延缓了草莓感官品质的下降

香气、光泽、颜色和形状（与枯萎有关）是代表草莓质量的重要指标。正如预期的那样，在15天的储存期内，香气、光泽、颜色和形状的个体和总体得分呈下降趋势（图2）。然而，HNW灌溉不同程度地延迟了上述感官评分的降低，尤其是在贮藏后期（9-15 d），在香气、光泽和颜色方面。考虑到感官质量综合评价的变化，我们随后提出，HNW灌溉可能会延长草莓的采后保质期。

3.3.HNW灌溉可维持草莓贮藏期间的TSS、TA、TSS/TA比率和Vc水平

TSS/TA比率是影响草莓风味和消费者偏好的一个重要指标。在本研究中，HNW处理的草莓在保持TSS方面表现出更好的性能。从第六天开始，SW组和HNW组之间的TSS存在统计学差异，并且这些变化在剩余的储存期内保持不变（表1）。相比之下，两种处理之间的TA变化不显著（第6天除外）。在此基础上，HNW灌溉明显延缓了草莓采后TSS（特别是）和TA含量的下降，使TSS/TA比值保持不变，尤其是在6–9d。

在施用HNW时Vc含量的响应中观察到类似的变化趋势（表1）。

3.4.HNW灌溉后储存期间硬度、木质素、果胶、纤维素和半纤维素含量的变化

在某种程度上，草莓的硬度决定了采后的保质期以及对机械损伤和真菌感染的敏感性。为了评估贮藏过程中上述HNW功能的机制，对果实硬度的变化进行了评估。正如预期的那样，HNW灌溉有利于提高草莓果实在收获（0d）时的硬度。例如，与SW处理的果实（5.25±0.08N）相比，HNW组（6.02±0.11N）的硬度明显增加了14.67%（图第3A段）。在贮藏15d期间，HNW处理组的草莓硬度虽然呈下降趋势，但始终高于SW组。

由于木质素、果胶、纤维素和半纤维素的含量及其在细胞壁中的分布与果实的硬度密切相关，在草莓中进一步测量了这些化合物的含量。与果胶不同，HNW灌溉使草莓果实在收获时（0d）的木质素、纤维素和半纤维素含量增加（图3B-E），与SW处理组相比。在储存15天期间，与SW处理相比，HNW组中明显观察到更高水平的木质素和纤维素含量，尽管无论HNW灌溉如何，这两种化合物的含量都显示出下降趋势。相比之下，除了储存的第9天外，果胶水平没有发现显著差异。

3.5HNW灌溉后生长条件下的木质素、纤维素和半纤维素

为了深入了解上述HNW延长草莓果实货架期的机制，我们随后分析了在生长条件下，HNW灌溉是否影响木质素、纤维素和半纤维素生物合成相关基因的转录丰度。在不同的发育阶段，可以清楚地观察到参与纤维素和半纤维素合成的CesF1和CesF6的表达水平（图4A和C）在绿色果实（G代表CesF1）、绿色果实和转向果实（G和T代表CesF6）中被HNW增加。相比之下，HNW灌溉上调了CesF4的表达（图4B）在果实转向和成熟阶段（T和R）。

由于CCR和CAD是木质素生物合成的两个关键酶，随后分析了相关基因的表达水平。正如预期的那样，HNW灌溉使CCR和CAD转录物都有不同的增加，并且观察到CCR在G和T阶段的显著变化（图4D），以及CAD在G、T和R阶段出现的变化（图4E）。

一致地，相关性分析清楚地表明，草莓在收获期的细胞壁成分（果胶除外）含量、生物合成相关基因变化和硬度之间存在强烈的正相关关系（图5）。